Corso di Laurea Magistrale in Scienze animali - SAN

Genomica vegetale

Anno accademico 2011/2012

Sommario insegnamento

• Obiettivi formativi
• Risultati dell'apprendimento attesi
• Programma
• Testi consigliati e bibliografia
• Strumenti didattici

Obiettivi formativi

Conoscenza approfondita sulle mappe genetico-molecolari (basi fisiche e cromosomiche della ricombinazione di geni marcatori associati, popolazioni di mappaggio), sulle mappe fisiche (principali metodi di sequenziamento dei genomi) e sugli strumenti di analisi trascrittomica e proteomica adottati per lo studio dell’espressione genica.

Risultati dell'apprendimento attesi

Il corso si propone di fornire le conoscenze sugli approcci utilizzati per lo studio della genomica strutturale e funzionale. In particolare, verranno fornite le conoscenze sulle strategie e sui metodi utilizzati per la costruzione di mappe fisiche e genetico-molecolari e sugli strumenti di analisi trascrittomica e proteomica adottati per lo studio dell’espressione genica.

Programma

Genomica strutturale

Costruzione di mappe genetico-molecolari e fisiche

Costruzione di mappe genetico-molecolari: basi fisiche e basi cromosomiche della ricombinazione di geni marcatori associati. Popolazioni segreganti utilizzate per la costruzione di mappe genetico-molecolari: BC1, F2, RIL (linee inbred ricombinanti), DH (di-aploidi) ed F1 (pseudo-test cross). Confronto tra modelli di segregazione (marcatori co-dominanti e dominanti).  MAS: definizione e principi. Individuazione di marcatori associati a caratteri monogenici: Analisi dei segreganti riuniti (BSA=Bulked Segregant Analysis); Linee quasi-isogeniche (NIL=Near Isogenic Lines). Individuazione di marcatori associati a caratteri poligenici: (QTL): analisi QTL ai singoli marcatori (simple mapping); analisi QTL per intervalli (interval mapping). Linkage disequilibrium (LD): mappaggio per associazione

Costruzione di mappe fisiche: confronto tra mappe genetiche, mappe fisiche e citologiche. Tecnica FISH. Costruzione di librerie genomiche e vettori di clonaggio (plasmidi, batteriofagi, cosmidi, PAC, BAC, YAC). Sequenziamento del genoma: metodo gerarchico, metodo shotgun.

Sequenziamento DNA: metodo Sanger; metodi di marcatura; sequenziatori automatici a gel e capillari. Pirosequennziamento.

Altre tecniche di sequenziamento (ULCS: Ultra-low-cost-sequencing): 1. metodi microelettroforetici; 2. sequenziamento tramite ibridazione (sequencing-by-hybridization’, SBH Affymetrix e Perlegen); 3. osservazioni real-time di singole molecole (sequenziamento tramite nano poro, Oxford Nanopore Technologies Ltd; Heliscope); 4. sequenziamento cyclic-array (454 pirosequenziamento, Illumina technology, AB Solid). Pair-end and mate-pair sequencing.

Metodi di sequenziamento di terza generazione: SMRT DNA sequencing, Single Molecule Real Time Pacific Biosciences; FRET-based approach to single-molecule sequencing, Förster Resonance Energy Transfer, VisiGens Biotechnologies (Life Technologies); Ion torrent. Cosa sequenziale: esoma, epigenoma (DNA –binding proteins; DNA metilato).

Progetti genoma nelle piante

Identificazione e annotazione del genoma:

I Genomi degli Eucarioti e loro caratteristiche (contenuto di DNA, numero di cromosomi, contenuto di eucromatina ed eterocromatina, compattezza, contenuto di G+C).

Definizione di gene e famiglie geniche. Geni che codificano proteine, geni che non codificano proteine. Gene ontology. Porzione non codificante del genoma (pseudogeni, ripetizioni intersperse e ripetizioni in tandem)

Genomica funzionale

Analisi dell’espressione genica

One-gene approach: northern blot e qPCR; Large-scale approach: (i) metodi basati sulla PCR e sulla visualizzazione di profili di frammenti di cDNA su gel ad alta risoluzione: DD (Differential Display),  SSH (Suppressive subctractive hybridization), RDA (Representational difference analysis), cDNA-AFLP; (ii) metodi basati sull’ibridazione di cDNA marcato a sonde immobilizzate su un supporto solido:  Macroarray e Microarray; (iii) metodi basati sul sequenziamento dei trascritti:SAGE, CAGE e RNA-seq

Analisi proteomica

Strumenti di Separazione e Display : “One-protein approach”: Western Blot (in 1DE e/o 2DE); “Large-scale approach”: Elettroforesi bidimensionale (2-DE).

Strumenti di identificazione proteica: sequenziamento con la chimica di Edman, spettrometria di massa.

Caratterizzazione funzionale

Strategie per creare una mutazione: agenti chimici, agenti fisici e agenti biologici (Mutagenesi Inserzionale con T-DNA o treasposoni). Genetica diretta (FORWARD GENETIC), positional cloning e insertional mutagenesis; Genetica inversa (REVERSE GENETIC): insertional mutagenesis, RNAi e Tilling.

Esercitazioni pratiche

Protocollo di clonaggio e espressione di geni con approccio Gateway

I testi base consigliati per il corso sono: ‘Introduzione alla genomica’ G. Gibson, S.V. Muse. Ed. Zanichelli ‘Genetica e genomica’ G. Barcaccia, M. Falcinelli vol.3. Ed. Liguori Il materiale didattico presentato a lezione sarà disponibile sul sito internet.

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